熒光定量pcr儀工作原理

將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。

　　Ct值（Cyclethreshold，循環閾值）的含義為：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。

　　1. 熒光閾值（threshold）的設定

　　PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold= 10*SDcycle 3-15

　　2. Ct值與起始模板的關系

　　每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，公式如下。

　　Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

　　n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。

　　起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。